PCR metoden och dess olika användningsområden

8 röster
37471 visningar
uppladdat: 2002-08-11
Inactive member

Inactive member

Nedanstående innehåll är skapat av Mimers Brunns besökare. Kommentera arbete
Detta specialarbete, inriktat på PCR, gjordes under våren 2002.
Handledare: Vivianne Jonsson. Rudbecksskolan, Sollentuna.



Innehållsförteckning _

Sid:

- Inledning 2


- Polymerase Chain Reaction 3-8

Bakgrund 4
Metod 4
Beskrivning av PCR-cykel 5
Temperaturbestämmande faktorer 6
Varför polymeraset Taq? 6
Kontroll av resultat 7
Användningsområden för PCR-produkter 7
Framtiden 8


- Romanov – mysteriet med den ryska tsarfamiljen 9-15

Bakgrund 10
Nya undersökningar 10-11
Identifiering med hjälp av DNA-analys 12-14
Analys 15


- En delning för mycket? 16-19

Syfte 17
Material och materiel 17
Utförande 17-18
Resultat 19
Felkällor 20
Slutsats 20


- Reflektion 21


- Källor 22



Inledning _

PCR har beskrivit som en av de mest fantastiska upptäcker inom den gentekniska världen. Dess genomslagskraft har varit enorm och på endast ett fåtal år har den blivit oumbärlig för den gentekniska forskningen. Genom att kopiera fram stora mängder DNA från en liten mängd ursprungligt DNA har den minskat både arbetsbördan samt tidsåtgången för forskarna.

Jag har i detta specialarbete valt att titta på PCR metoden på tre olika sätt. Hur själva metoden fungerar, hur man kan använda PCR i forskningssyfte samt så har jag själv provat på att använda metoden i praktiken.


Polymerase Chain Reaction


Bakgrund _

PCR står för polymeras chain reaction. Ett polymeras är ett naturligt förekommande enzym som finns i alla levande organismer. Dess uppgift är att katalysera reaktionen som skapar nytt eller reparerar DNA (i vissa fall även RNA). Denna förmåga har vi människor lärt oss att stoppa och starta genom att reglera temperaturen i den miljö som enzymet arbetar i. Genom att blanda enzymet plus det DNA man vill amplifiera och sedan köra ett PCR-program kan man få DNA att exponentiellt växa genom en cykel av olika temperaturhöjningar och sänkningar, den så kallade chain reaction.

Tekniken uppfanns av Kary B. Mullis 1983 när han satt och funderade under en biltur (5). Det finns dock de som hävdar att Mullis endast kom på det sista steget och inte ska ta all ära eftersom flera forskare har varit med och tagit fram de olika delstegen som sedan Mullis lyckades pussla ihop till PCR (7). Det var han som systematiskt provade fram de olika temperaturerna och tiderna och slutligen fick fram den mest lämpade miljön för metoden. Upptäckten gav honom Nobelpriset i kemi 1993.

Det som slog de flesta med häpnad var att PCR-metoden var så enkel. Det förvånade forskare världen över att ingen hade tänkt på det tidigare.

PCR har visat sig mycket användbar inom många områden, t ex i medicinsk behandling och forskning, även rättsmedicin och djurforskning har dragit nytta av tekniken.


Metod -

Det viktigaste som måste stämma i en PCR analys är designen på primers. Dessa är oligonukleotider som har specifika bindningsställen på DNA-strängen (template). Primern binder till en sekvens precis framför den sökta genen. Polymeraset Taq binder sedan till primern och börjar avläsningen där. Primer och template behöver inte matcha helt, bara en stabil bindning bildas. Primern ska vara så kallad komplementär till sekvensen. Den totala storleken på DNA-fragmentet som ska amplifieras bör inte vara mindre än 1 kilobaser (kb) men inte heller överskrida 3 kb för att ett bra resultat ska uppnås. Det är möjligt att amplifiera fragment upp till 40 kb, men då måste speciella metoder användas (1).

Längden på primer spelar en betydande roll om försöket ska lyckas eller inte. Är primers för korta leder detta till att de blir komplementära till många fler sekvenser på genomet. Då amplifieras flera olika, oönskade fragment samt det som söktes. Detta gör det omöjligt att lokalisera det eftertraktade fragmentet. Är däremot primers för långa innebär det att de binder långsammare till den komplementära strängen. Detta leder till att PCR-metoden inte kan amplifiera tillräckligt många DNA-molekyler och resultatet blir inte korrekt. Den optimala längden på primern är 17 nukleotider. Med 17 nukleotider är primern tillräckligt lång för att bara matcha på endast en plats i genomet och är tillräckligt kort för att kunna hybridiseras (1).

Själva cykeln består av tre olika delmoment. Denna cykel körs normalt sett i 30-40 gånger för att man ska få tillräcklig stor mängd DNA. DNA ökar exponentiellt i varje cykel och vid slutet av PCR har man fått en mycket större mängd DNA än det man startade med. Ett helt program bestående av ca 35 cyklar tar ungefär 1,5 till 2 timmar.

Beskrivning av PCR-cykel _

1) Denaturering.
Vid en temperatur på ca 94 °C så smälter vätesbindningarna mellan den dubbelsträngade DNA-molekylen och enkelsträngat DNA bildas. Alla enzymreaktioner upphör att fungera på grund av den höga temperaturen. Körs under ca en minut.

2) Annealing.
De enkelsträngade primers, som tillsattes innan försöket påbörjades, bildar vätebindningar med de enkelsträngade DNA-molekylerna. Annealingen har en arbetstemperatur på ca 54 °C och pågår i en minut. Molekylerna bryts och bildas oavbrutet beroende på hur stabila de är. Har primern hittat en komplementär sekvens bildas en stabil bindning. Där fäster sedan polymeraset och börjar kopiera DNA-sekvensen.

3) Extension.
Extensionen fortgår i ca två minuter. Vid ca 72 °C arbetar polymeraset som bäst. De primers som inte bundit med alla nukleotider under annealing steget bryts i detta steg söder på grund av den högre temperaturen. Endast de primers som bundit exakt med DNA-sekvensen kopieras. Polymeraset som används i PCR kommer från bakterien Thermus aquaticus (Taq). Dess unika egenskap är att den utan problem kan arbeta effektivt i höga temperaturer (10).

Temperaturbestämmande faktorer _

De olika stegen arbetar under noggrant fastställda temperaturer för att maximal effekt ska uppnås. Den höga temperaturen vid denatureringen gör att alla strängar sönderdelas samt att alla naturligt förekommande enzymer, förutom det tillsatta Taq, inaktiveras.

Temperaturen som används vid annealingen spelar en stor roll om hur stor specificering försöket ska ha. Är temperaturen för låg binder primers vid för många ställen och leder till att en för stor mängd sekvenser amplifierade eftersom primers kan bilda stabila bindningar med icke-komplementära sekvenser. Är däremot temperaturen för hög bildas inga bindningar alls, utan primers och DNA-strängar fortsätter vara obundna. Så den ideala temperaturen för annealing steget måste vara tillräckligt hög för att förhindra bindningar mellan primers och icke-önskade sekvenser, men tillräckligt låg för att primers ska ha en chans att binda till de komplementära sekvenserna (1).

För att räkna ut denna perfekta temperaturen använder man sig av smälttemperaturen (Tm) för varje primer–template hybrid. Smälttemperaturen anger vid vilken temperatur som bindningarna mellan dessa kommer att smälta. Om man sedan lägger annealing temperaturen en till två grader under denna får man en lagom temperatur. När man vill räkna ut smälttemperaturen använder man sig av en enkel formel baserad på hur många och vilka nukleotider primern består av (1).

Tm = (4 x [G + C] ) + ( 2 x [A + T] )

Man ska dock ta i beaktande om man använder sig av flera olika primers i samma försök, då dessa måste designas så de har samma Tm. Annars innebär det att någon av primers kan haverera på grund av för hög temperatur.


Varför polymeraset Taq?

Från början, när tekniken var ny, använde man sig av ett polymeras från bakterien E. coli. (10) Detta var inte särskilt effektivt eftersom denatureringssteget, på grund av sin höga temperatur, inaktiverade polymeraset och nytt polymeras måste tillsättas i varje cykel, en mycket tidsödande metod. Man studerade bakterier som levde i varma källor med temperaturer runt 100 °C och fann en bakterie som frodades i dessa temperaturer, Thermus aquaticus. Från bakterien renades Taq polymeraset fram som utan svårigheter klarade denatureringssteget på 95 °C och var lika effektivt under alla cykler. Genom denna upptäckt lyckades man förenkla hela PCR genom att det tidsödande steget med att tillföra nytt polymeras togs bort.

I och med att man bytte ut E. coli polymeraset mot Taq blev även säkerheten större med testerna. Användningsmöjligheterna ökade och man kunde nu t ex amplifiera längre och känsligare sekvenser (10).


Kontroll av resultat _

Innan man kan använda produkterna från PCR är det viktigt att man kontrollerar att försöket verkligen har lyckats. Produkterna kontrolleras antingen genom gelelektrofores, direkt sekvensering av produkten eller så klonar man PCR-produkten. Följande villkor måste vara uppfyllda:

1) En produkt har bildats. Även om metoden är väl utarbetad och kontrollerad, är det inte säkert att PCR varje gång lyckas med att bilda en produkt. DNA som användes kan ha varit för dålig eller så passade kanske primern inte in.

2) Produkten har rätt storlek. Det kan t ex hända att man får en produkt som är ca 400 baspar (bp) lång, när det förväntade resultatet var 1600 bp. Detta kan bero på felkonstruktion av primers.

3) Rätt antal band på elektroforesen syns. Ibland kan primers binda till fler än den önskade sekvensen vilket leder till flera band blir synliga än de väntade resultatet.

Som hjälp vid analys av produkterna har man en allelic ladder. Denna tillsätts i en egen brunn och visar bestämda band på gelen som man kan använda som storlekskontroll på sina egna prover.


Användningsområden för PCR-produkter _

Den största fördelen som har erhållits med PCR är möjligheten att få fram stora mängder DNA från ytterst lite ursprungligt DNA. Detta har bland annat underlättat för rättsmedicinska undersökningar. Vid brottsplatser hittar man kanske ett hårstrå eller lite saliv, men inte tillräckligt för att kunna analysera DNA direkt genom t ex gelelektrofores. Men med hjälp av PCR kan man nu kopiera upp så stora mängder DNA så att en analys kan göras och därmed binda en misstänkt vid brottet.

Även inom den medicinska världen har PCR underlättat forskarnas vardag. Speciellt när det gäller identifiering av sjukdomsframkallande organismer och identifiering av ändringar eller mutationer i gener (med betoning på mänskliga gener). Tittar man endast på en cell, vilket är möjligt med hjälp av PCR, kan man se mutationer snabbare och härleda dem arvsmässigt. Det har även visat sig enkelt att analysera sjukdomsframkallande organismer som tidigare var omöjliga att analysera för att de inte gick att odla på agarplattor eller i något annat medium. Med PCR kan man genom sekvensering få reda på organismens genom och sedan analysera fram vilken gen som orsakar sjukdomen.

Personer som har ärftliga sjukdomar i släkten kan, om sjukdomsgenen är känd, få sitt genom kontrollerat för att få reda på om de har sjukdomen eller inte (1).


Framtiden _

När PCR gjorde sitt intåg inom gentekniken för lite mer än tio år sedan revolutionerade den all verksamhet. De framsteg som har gjorts inom PCR sedan dess visar på att metoden är långt ifrån färdig. Genom att ändra olika variabler, såsom pH och kemiska reagens, har man visat att betydligt större fragment kan amplifieras.

Även apparaten som utför PCR förfinas. Slutmålet vore en datachipsbaserad maskin som kunde ge resultat på minuten (5). Endast för några år sedan tog en PCR-labb en dag, idag tar de modernaste maskinerna runt 20 minuter på sig för ett program. PCR har givit gentekniken otroliga möjligheter och förenklat mycket forskning. Utan den hade dagens genforskning inte funnits.


Romanov
– Mysteriet med den ryska tsarfamiljen.


Bakgrund

Mordet
Den 16 juli 1918 mördades hela den ryska tsarfamiljen efter att ha suttit fängslade i Ipatiev- huset, Ekaterinburg en kortare tid. Deras banemän var bolsjeviker som en gång för alla skulle utplåna det ryska tsardömet. Familjen, bestående av tsar Nicholas II, tsarinnan Alexandra, deras döttrar Olga, Tatyana, Maria och Anastasia, och deras enda son Alexi, samt tre tjänare och en läkare, tvingades ner i källaren i huset där de hade varit fängslade, och avrättades. Bolsjevikerna använde sig först av vapen men sedan, när det visade sig att inte alla hade dött av skotten, misshandlades de överlevande till döds bland annat genom hårda slag av gevärskolvarna mot huvudet.

Kropparna kläddes av och slängdes på ett lastbilsflak. Vad som hände sedan vet man inte riktigt men den mest sannolika versionen var att kropparna skulle dumpas i ett närliggande gruvschakt, men lastbilen fick motorproblem och bolsjevikerna var tvungna att gräva en provisorisk grav och begrava kropparna där (9). Graven blev inte djup, knappt en meter. För att förhindra identifiering av offren hälldes svavelsyra ned i graven, så att kropparna (främst ansiktena) skulle frätas sönder. När graven väl var övertäckt plattades marken till så att området inte skulle väcka misstankar.

Lokaliseringen av gravplatsen
Morden undersöktes inte speciellt noggrant. 1918 till 1919 gjordes en undersökning av en vitrysk monarkist vid namn Nicholas Sokolov. Han hittade spridda bevis, så som rester av kläder, men aldrig någon gravplats eller några kroppar. Hans slutsatser publicerades i bokform i sju volymer och accepterades officiellt som förklaring vad som hade hänt, men kropparna hittades aldrig.

Det fanns en hemlig redogörelse av morden från en bolsjevik vid namn Yakov Yurovsky. Han hade varit ansvarig för avrättningarna och hans redogörelse var en rapport över vad som hade hänt den dagen. Hans version skiljer sig från den tidigare nämnda för enligt honom var den grunda graven den andra begravningsplatsen för offren (2). De hade först slängts ned i ett gruvschakt, men två dagar senare hade de flyttats och begravts under jord av rädsla för att den vita armén skulle hitta kropparna.


Nya undersökningar

I april 1989 trädde filmaren Geli Ryabov fram, och hävdade att han hade lokaliserat den riktiga gravplatsen, åtta kilometer från där Sokolov hade trott att den låg. Tio år tidigare hade han och geologen Alexander Avdonin hittat graven genom att studera Yurovskys uttalande och fotografier. Ryabov och Avdonin hade då tagit tre skallar från graven, bara för att ett år senare lämna tillbaka dem. De var alltför rädda för att behålla dem.

Först 1991 tillät den dåvarande presidenten Boris Jeltsin en officiell undersökning av gravplatsen. Man fann där över tusen olika benfragment som kunde pusslas ihop till nio olika skelett. Alla skelett var svårt skadade och visade tydliga tecken på brutalt våld. Det saknades två skelett, men detta kunde förklaras genom uppgifter från Yurovskys anteckningar som beskrev att två av offren hade bränts istället för att begravas med de andra (2). Forskarnas uppgift var nu att ta reda på vilka personer skeletten en gång hade varit.


Analys av skeletten
Ryska forskare satte genast i gång med att analysera och försöka komma fram till skelettens identitet. Karakteristiska drag från skallarna bearbetades med hjälp av en dator och på så sätt fick man fram fantombilder. Dessa bilder försökte man sedan para ihop med fotografier av tsarfamiljen. Svavelsyran hade dock förstört så mycket så att några bestämda svar inte kunde ges. Flera av skallarna hade tandfyllningar gjorda av guld, porslin och platina vilket tydde på att de kom från en högre samhällsklass än de andra i graven som inte hade några lagningar alls (9). Efter att ha bestämt kön och ålder på offren så var den ryska forskningsgruppen, ledd av Sergei Abramov, säkra på att de hade hittat tsaren, tsarinnan, tre tjänare, läkaren och tre av döttrarna. Enligt deras slutsats var det prinsen Alexi och prinsessan Maria som saknades i massgraven (2).

Resultatet offentliggjordes på en presskonferens som en amerikansk forskare vid namn Dr. William Maples deltog vid. Han hade, utan att nämna det till Abramovs, frågat de lokala myndigheterna, och fått lov att mer eller mindre ta över utredningen. Hans imponerande grupp bestående av olika experter inom området kom och körde ut Abramov (2).

När Maples grupp kom till Sverdlovsk, hittade de skeletten liggande oskyddade mot solljus, värmeändringar och nedsmutsning på varsin bår i ett lokalt bårhus. Några av de långa benen hade sågats itu för analyserna vid fastställandet av identiteterna. Detta försvårade bestämningen av längd på skeletten. Till största del kom Maples grupp fram till samma sak som Abramovs grupp hade gjort, förutom att de hävdade att inget av skeletten var tillräckligt ungt för att vara Anastasia, den yngsta dottern i tsarfamiljen (2). Det var hon som saknades tillsammans med sin bror, inte Maria som Abramovs grupp hade kommit fram till.

Abramov höll fast vid sin ursprungliga åsikt. Det var trots allt han som hade mätt och analyserat skeletten innan de sågades itu, och han hade därmed en bättre utgångspunkt än Maples. Maples hade fastställt identiteten genom att analysera armpiporna och armbågsbenen, vilka, enligt Abramov, kan ha hamnat i oordning på bårarna och därmed gett missvisande resultat.

Maples hävdade att hans teori stämde genom att hänvisa till att alla skelett i graven hade karaktäristiska drag som finns hos vuxna människor. Om 17-åriga Anastasia skulle ha funnits i graven skulle man ha märkt det på det ej helt utvecklade skelettet.

För att få ett slutgiltigt svar skickades delar av alla skelett till England, där Peter Gill och hans forskargrupp utförde DNA analys av alla nio skeletten (till skillnad från de tidigare undersökningar där man endast hade använt sig av skelettens utseende för att få resultat). Därmed skulle man få reda på om det fanns något släktband mellan skeletten och om det verkligen var Romanovfamiljen.


Identifiering med hjälp av DNA-analys med PCR-metoden

Metoderna, som den engelska forskningsgruppen använde sig av, var short tandem repeat (STR) och analys av mitochondrial DNA (mtDNA) (9). STR har visat sig vara mycket pålitligt när man analyserar släktskap mellan olika individer. Metoden är precis densamma som PCR, man kopierar upp stora mängder DNA från lite ursprungligt DNA och analyserar sedan, efter behandling, med hjälp av gelelektrofores. Analys av mtDNA har visat sig vara mer effektivt eftersom mtDNA har längre hållbarhet än kromosomalt DNA och har ett högre copynumber i cellerna (9). En annan fördel med mtDNA att det endast ärvs från moderns sida. Därmed kan släktskapet mellan individer, besläktade på moderna sida, i olika generationer studeras. Engelsmännen använde sig därför av båda metoderna; mtDNA analysen för att fastställa släktskap mellan skeletten och kända släktingar till Romanov familjen. STR för att ta reda på om skeletten tillhörde samma familjegrupp.

DNA extraktion och koncentrering (9)
De yttre delarna på benen filades bort och de resterande fragmenten, ca 1 gram, frystes ned med flytande nitrogen för att sedan malas till ett finkornigt pulver. Detta pulver blandades sedan med 2 ml 0.5 M EDTA innehållande proteinas K, och inkuberades i 37oC över natten. Blandningen extraherades sedan två gånger med fenol, två gånger med fenol/kloroform lösning och centrifugerades sedan i en timme. Koncentraten tvättades två till tre gånger med 3 ml destillerat vatten och centrifug i en timme. Extraktet från benen kvantifierades genom hybridisation med ett humantspecifikt DNA probe kit.

Med hjälp av amplifikation (genom PCR) av en homolog gen till X/Y kromosomen, amelogenin, kunde den engelska forskningsgruppen enkelt ta reda på och verifiera sina kollegors slutsats att det fanns fyra män och fem kvinnor i graven.

STR
För att analysera släktskapen mellan de nio olika skeletten amplifierades fem olika STR loci från alla skelett. De loci som användes var HUMTH0110, HUMVWA3111, HUMF13A112, HUMFES/FPS13 och HUMACTPB14 (9). Från varje skelett togs det ca 20-40 pg DNA för amplifieringen. Denna mängd motsvarar 3-7 diploida kopior av genomet. Så små mängder leder oftast till ojämn, om ens någon, amplifiering. Så för att försäkra sig om rätt resultat, analyserades alla prover minst fyra gånger. De som var homozygota analyserades minst sex gånger för hållbara bevis. Vid alla försök uppnåddes samma resultat och därmed kunde man utesluta nedsmutsning.

Varje individ har ett specifikt antal upprepningar av det kända fragmentet som användes vid STR. Banden ser olika ut på gelen beroende på hur många upprepningar individen har. Antal upprepningar ärvs av individen från föräldrarna. Genom att jämföra antalet upprepningar kan man alltså fastställa vem som är släkt med vem. Resultatet visas i tabellen på nästa sida.


Från tabellen kan det avläsas att skelett 3-7 kan klassificeras som en familjegrupp med skelett 4 och 7 som föräldrar (9). De andra skeletten har samma mängd upprepningar på vissa ställen, men avviker på andra, och kan därmed uteslutas som tänkbara släktingar. Med detta bevisades
att i graven hade det funnits en familj plus fyra icke-besläktade individer. Vad som nu måste bevisas var att det verkligen var Romanovfamiljen.

Analys av mtDNA
Genom att analysera mtDNA kan man lätt härleda släktskap genom flera led på moderns sida. Detta gör att man kan använda sig av avlägsna släktingar flera generationer bakåt.

Båda strängarna från de hypervariabla mtDNA regionerna som valdes för labben sekvenserades hos alla individer. Familjegruppens mtDNA extraherades och sekvenserades dubbelt för att säkerställa samma resultat två gånger. Resultatet visade inga avvikelser mellan de olika testomgångarna. Regionerna som analyserades var bas 16020 till 16400 (första hypervariabla regionen) samt bas 48 till 408 (andra hypervariabla regionen) (9).

När de nio benproverna analyserades fann man att sex olika sekvenser fanns inom gruppen. Dessa varierade i genomsnitt med sex nukleotider. Man fann även att den hypotetiska modern och de tre barnen hade identiska sekvenser (9). Nu behövdes det bara blodprover från tsarens och tsarinnans släktingar, för att slutligen fastställa att det verkligen var tsarfamiljen som hade hittats.

Prins Philip, hertig av Edinburgh, är dotterson till tsarinnans syster. Han donerade ett blodprov för jämförelse av hans mtDNA med den påstådda tsarinnans mtDNA. Provet bevisade att det verkligen var tsarinnan och att hon var mor till de tre barnen. Alla fem mtDNA sekvenser var identiska.

Nu återstod att fastställa tsarens identitet. Detta visade sig mycket svårare. Hans systerson vägrade att samarbeta med forskningsgruppen som protest mot att England hade vägrat tsarfamiljen en fristad under revolutionen (6). Slutligen hittade man två mer avlägsna släktingar, Xenia Sfiri och Hertigen av Fife, som var villiga att ställa upp med blodprov. Även dessa två var släkt med tsaren på hans mors sida, ett krav vid analys av mtDNA.

Vid analysen av blodproverna samt benprovet stötte man på komplikationer. Proverna visade exakt samma sekvens med ett undantag. En nukleotid på plats 16169 var annorlunda på tsarens sekvens jämfört med hans släktingars (9). Tsaren hade nukleotid C där släktingarna hade nukleotid T. Vid noggrannare undersökning visade det sig att tsaren hade hetroplasmy. Heteroplasmy är när en individ har olika nukleotider på samma position i genomet.


Tabell över tsaren (1) och hans två (2 och 3) släktingars mtDNA sekvenser. Vid position 16169 kan man se
heteroplasmy på tsarens sekvens jämfört med släktingarnas.

En noggrannare undersökning av tsarens sekvens visade att heteroplasmy förekom på denna position med ungefärliga förhållandet 3,4: 1, och det rörde endast nukleotiderna C och T (9). Denna typ av heteroplasmy fann man även i ett nytt prov taget från skelett 4. För att fastställa hypotesen ligerades produkterna från skelett fyras prover in i pUC8 och transformerades in i E. coli. Vid analys av klonerna fann man att 28 av dem hade C på position 16169 och sju hade T på samma position (detta gav förhållandet 4:1, en acceptabel överrensstämmelse med tidigare, 3,4: 1) (9).

När den första analysen av tsarens heteroplasmy gjordes 1992, kunde man inte bestämt säga att det var tsaren man hade funnit. Den engelska forskningsgruppen sa att det var till 98,5 % sannolikt att det var tsaren man hade funnit i graven (9). Den troliga förklaringen till tsarens heteroplasmy ansågs då vara förorening av proverna. Först två år senare kunde tsarens identitet bevisas till 100 %. Då gavs tillstånd till en amerikans forskningsgrupp, ledd av Thomas J Parson, att öppna tsarens yngre brors, Georgij Romanovs, grav och ta ett DNA prov från honom. Man fann exakt samma avvikelser på Georgijs DNA (både C och T fanns på position 16169) som på tsar Nicholas (3). Detta bevisade att den heteroplasmy man funnit hos tsaren inte var en förorening utan en ärftlig avvikelse. Man antog att heteroplasmyn hade försvunnit genom mutation någonstans i generationerna efter tsaren (3). Men slutsatsen stod fast, det var verkligen tsaren man hade funnit i graven. Därmed var mysteriet med den försvunna tsarfamiljen löst. Det enda frågetecknet som fanns kvar var vad som hade hänt med prinsen och prinsessan. Den frågan har än idag inte fått någon lösning.


Analys

Den slutgiltiga utredningen, som utfördes i England, var den första i sitt slag inom den gentekniska forskningen. Aldrig förut hade både mtDNA och STR använts i samma labb för att fastställa identiteten och släktskap i en grupp. Innan man fick tillgång till tsarens brors DNA, och verkligen kunde fastställa att heteroplasmy var ett släktdrag, gjordes flera olika statistiska uträkningar med syfte att ta reda på om det var möjligt att skeletten verkligen var Romanovfamiljen. Detta försvårades av att det inte gick att få en bas över vita, ryska individer, som teoretiskt har mer liknande genom som tsarfamiljen, att jämföra med skelettens DNA (9). I stället användes en bas över vita individer från England, och detta ökade riskerna för felvisande resultat.

Men trots alla dessa resultat vilar fortfarande ett mystiskt skimmer över några av tsarfamiljens medlemmar. Vad hände egentligen med de två saknade kropparna, den enda sonen och en av döttrarna? Enligt vittnet Yakov Yurovsky brändes två av barnens kroppar separat. Men ingenting har kunnat bevisas. Rykten har gått om vad som egentligen hände med prinsen och prinsessan. Många talar om att de undkom och har levt i det okända någonstans i Europa. Det finns enstaka personer som har trätt fram och hävdat att de är den saknade prinsessan Anastasia, men tack vare DNA-analyserna har man nu kunnat avfärda dessa genom att jämföra deras DNA med de skelett man fann i graven i Ekaterinburg. Men den täta mystiken kring prinsens och prinsessans försvinnande dröjer nog kvar ett bra tag till.


En delning för mycket?

En PCR-labb angående DNA-banden mellan mig och min tvillingsyster.


Syfte:

Syftet med labben var att jämföra mitt DNA med min tvillingsysters DNA för att fastställa om vi är enäggstvillingar eller inte.

Material och materiel:

PCR-buffert, proteinas K, TE-buffert, Centrikon-100 ultrafiltreringsenhet, sax, pincett
Reaction mix, MgCl2-lösning, 250 ng/ml Control DNA 3-lösning, sterilt destillerat vatten
3 % högupplösande agaros, TBE-buffert, EtBr, BTB, D1S80 Allelic ladder


Utförande: _


DNA-extraktion från hårrötter med proteinas K.

Två Eppendorfrör (E-rör) markerades med M (Maja) respektive F (Frida) och 500 ml PCR-buffert samt 10 ml proteinas K-lösning tillfördes till vardera rör.

En sax samt en pincett steriliserades med hjälp att etanolbrännare. Tre hårstrån med tydliga, rejäla rötter togs från respektive skalle. Rötterna fördes ned i PCR-buffert/proteinas K-blandningen. Hårstråna klipptes av så den totala längden blev 1 – 1, 5 cm.

Rören inkuberades i 56 °C vattenbad i fyra timmar så att DNA skulle frigöras från cellerna. Proverna placerades därefter i ett kokande vattenbad i tio minuter för att inaktivera proteinaset. Sedan centrifugerades rören i två minuter i 13000 x g.

Centrikon-100 ultrafilteringsenheten sattes ihop enligt bilden nedan:

Till enhetens övre del tillsattes 1,5 ml TE-buffert, ovanpå detta applicerades hela provet med extraherad DNA (500 ml). Enheten centrifugerades i en ”fixed-angle” rotor vid 100 x g i 25 minuter. Kvar blev ca 50 ml koncentrerad DNA i den övre delen medan överskottet hamnade i den undre delen. Dessa 50 ml frystes in för att hålla sig till dagen efter då laborationen skulle fortsätta.

PCR-amplifikation.

20 ml av Reaction mix och 10 ml 5mMgCl2 tillsattes fyra 0,2 ml E-rör.
1. DNA från Maja
2. DNA från Frida
3. Negativ kontroll
4. Positiv kontroll

Till provrör 1 och 2 tillsattes 20 ml av det infrysta DNA-provet, M respektive F. 20 ml 150 ng/ml Control DNA 3-lösning tillsattes till provrör 4 medan provrör 3 fick 20 ml steril destillerat vatten. Totalvolymen i samtliga rör blev 50 ml.

Alla provrören placerades i PCR-maskinen. Denna programmerades efter följande schema:

Program No 1 Cycles 1 Link to 2
Segment Temperature Rate Hold time Inc temp Inc time
1 95 °C MX 15 sek 0 0
2 66 °C MX 15 sek 0 0
3 72 °C MX 40 sek 0 0

Program No 2 Cycles 30 Link to E
Segment Temperature Rate Hold time Inc temp Inc time
1 72 °C MX 10 min - -

Programmen kördes och var färdigt efter ca 1,5 timmar. Proverna frystes in i väntan på analys.


Analys av proverna med gelelektrofores.

2000 ml TBE-buffert blandades till genom att späda 200 ml koncentrerad buffert späddes med 1800 ml vatten. Till gelen användes 200 ml av bufferten samt 9,7 g högupplösande 3 % agaros och 10 ml EtBr. Gelen göts tunn. Till de resterande 1800 ml TBE-buffert tillsattes 90 ml EtBr och bufferten hälldes över gelen.

Varje gelprov innehöll 3 ml TE-buffert, 3 ml BTB-färg samt 20 ml DNA (M/F/+/-). Ett gelprov blandades till med 3ml TE-buffert, 3 ml BTB-färg samt 5 ml D1S80 Allelic ladder. Samtliga prover placerades i varsin brunn på gelen.

Elektroforesen kördes vid 150 V i ca två timmar tills färgmarkörerna hade flyttats tillräckligt långt på gelen. Gelen överfördes sedan till ett UV-bord och analyserades.


Resultat: _

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33



Gelen visade som väntat band vid proverna av Allelic ladder, positiva kontroll DNA, mitt DNA samt Fridas DNA. Jag och Frida hade ett likadant band, det övre. Men sedan hade Frida även ett band längre ner.


Felkällor: _

– Få celler i hårrötterna.
– T...

...läs fortsättningen genom att logga in dig.

Medlemskap krävs

För att komma åt allt innehåll på Mimers Brunn måste du vara medlem och inloggad.
Kontot skapar du endast via facebook.

Källor för arbetet

Saknas

Kommentera arbetet: PCR metoden och dess olika användningsområden

 
Tack för din kommentar! Ladda om sidan för att se den. ×
Det verkar som att du glömde skriva något ×
Du måste vara inloggad för att kunna kommentera. ×
Något verkar ha gått fel med din kommentar, försök igen! ×

Kommentarer på arbetet

Inga kommentarer än :(

Källhänvisning

Inactive member [2002-08-11]   PCR metoden och dess olika användningsområden
Mimers Brunn [Online]. https://mimersbrunn.se/article?id=1128 [2019-09-23]

Rapportera det här arbetet

Är det något du ogillar med arbetet? Rapportera
Vad är problemet?



Mimers Brunns personal granskar flaggade arbeten kontinuerligt för att upptäcka om något strider mot riktlinjerna för webbplatsen. Arbeten som inte följer riktlinjerna tas bort och upprepade överträdelser kan leda till att användarens konto avslutas.
Din rapportering har mottagits, tack så mycket. ×
Du måste vara inloggad för att kunna rapportera arbeten. ×
Något verkar ha gått fel med din rapportering, försök igen. ×
Det verkar som om du har glömt något att specificera ×
Du har redan rapporterat det här arbetet. Vi gör vårt bästa för att så snabbt som möjligt granska arbetet. ×